Авг
08
Опубликовано: 08 Авг 2010
Рубрика: Болезни пчел | Автор: admin

Методика постановки реакции непрямой иммуно-флуоресценции заключается в следующем. Десять — пятнадцать больных личинок или корочек тщательно растирают со стерильным физиологическим раствором. Полученную суспензию фильтруют через бумажный фильтр и центрифугируют при 5—6 тыс. мин-1 в течение 15 мин. Из полученного осадка на обезжиренных стеклах готовят 3—4 мазка, нанося материал по всей поверхности стекла. Приготовленные мазки фиксируют метанолом 5 мин и высушивают. На мазок наносят специфическую гипериммунную сыворотку и препараты на 30 мин помещают во влажную камеру при 37°С. После этого препараты промывают водопроводной водой, затем забуференным физиологическим раствором с рН 7,2—7,5 и высушивают. На высушенные препараты наносят меченную флюоресцеином изотио-цианата ослиную сыворотку против глобулинов кролика (производство института эпидемиологии имени Н. Ф. Гамалеи) в рабочем разведении и помещают во влажную камеру на 30 мин. Затем препараты промывают 10 мин в за-буференном физрастворе. Для устранения неспецифического свечения используют бычий альбумин, меченный родамином «Б», по общепринятой методике. Микроскопию проводят с помощью люминесцентного микроскопа под иммерсионной системой. В качестве иммерсионного масла используют диметилфталат. Для контроля специфичности на один из мазков наносят нормальную кроличью сыворотку в разведении 1 : 50. Реакция считается положительной

при интенсивном свечении и наличии четко обозначенных форм спор и вегетативных клеток Вас. larvae. Специфические гипериммунные сыворотки кроликов в нативном и лиофилизированном виде готовит УкрНИИЭВ и высылает ветлабораториям по предварительным заказам (310023, г. Харьков, ул. Пушкинская, 83).

Имеются данные об использовании бактериофага возбудителя американского гнильца, названного лярвейным, для ускорения и уточнения бактериологической диагностики (Н. И. Смирнова, 1956; V. Drobnikova, J. Ludvik, 1982). Фагодиагностика позволяет сократить срок исследования на американский гнилец до двух суток. Лярвейный бактериофаг может быть также применен для идентификации чистых культур Вас. larvae.

При применении фагодиагностики с целью идентификации культур Вас. larvae на поверхность чашки Петри с мясо-пептонным сывороточным агаром шпателем засевают две капли суточной бульонной культуры и наносят в центр каплю бактериофага, а затем переворачивают ее кверху дном и ставят в термостат на 24—48 ч. В положительном случае на месте протекания капли фага образуется полоса, свободная от роста микробов.

Ведутся поисковые работы по диагностике американского гнильца на основе определения в гнильцовых корочках некоторых специфичных химических соединений. Было обнаружено присутствие в экстрактах больных личинок и культурах Вас. larvae ароматических летучих кислот (валериановой, изовалериановой, капроновой и др.), которые отсутствовали в здоровых личинках (Т. Gochnauer, D. Shearer, 1981).